產品名稱：HY STEMCELL E8725F人間充質干細胞無血清培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基）

英文名稱：CCGmHuM? E8 Cocktail human MSCs Serum-Free Medium

產品貨號：E8725F

產品品牌：HY STEMCELL

一、?產品組份及概述
產品組份：

A.?CCGmHuM? E8?Cocktail?human MSCs?Serum-Free?Medium 基礎培養(yǎng)基 450mL ?4℃冷凍保存，產品批次和效期見：標簽 或 瓶身噴碼。

B.CCGmHuM? ?Human MSCs Supplement Medium（10x）細胞因子添加物50mL ?-20℃冰凍保存。（反復凍融5次內不影響產品質量）

貨號：E8725F ???????????????????成品 包裝規(guī)格為：450+50mL/瓶

本產品包括以下8種明確公開組份：

DMEM/F12?base ???????Essential?GFs

Glutamine ????????????Transferrin

NaHCO3 ??????????????Albumin

Selenium ?????????????Insulin

其中Essential?GFs為十余種蛋白生長因子，是人間充質干細胞（mesenchymal stem cell, MSCs）生長所必需的，以Cocktail形式融入E8725F無血清培養(yǎng)基中。

二、技術指標
1.物理性狀：添加劑呈淡黃色，澄清透明，PH7.0~7.6。

2.細菌培養(yǎng)：陰性

3.支原體培養(yǎng)：陰性

4.HBV-sAg：陰性

5.HIV-Ab：陰性

6.HCV-Ab：陰性

7.梅毒螺旋體抗體：陰性

8.牛血清白蛋白：陰性

9.熱源內毒素：小于1EU/mL

10.細胞生長：細胞為梭形，呈指紋狀或螺旋狀生長；原代細胞貼壁生長和傳代細胞生長良好。

三、?完全培養(yǎng)基的配制
將完全溶解的CCGmHuM? Human MSCs Supplement Medium（10x）細胞因子添加物加入到相應體積的基礎培養(yǎng)基中，充分混合均勻，制備成完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)基和CCGmHuM? Human MSCs Supplement Medium（10x）細胞因子添加物的混合比例為9:1，即每9mL基礎培養(yǎng)基需要添加1mL細胞因子添加物。
為維持添加物中細胞生長因子的活性，請將配制好的完全培養(yǎng)基置于4℃避光保存，儲存時間不宜超過4周，1周內用完最佳。

四、各種組織來源MSCs的使用說明及凍存
本產品可用于骨髓、臍帶、臍血、胎盤、脂肪等各種組織來源的人間充質干細胞（mesenchymal stem cell, MSCs）的培養(yǎng)，包括原代細胞的培養(yǎng)和傳代細胞的擴增。

本產品尤其適于臨床級MSCs的培養(yǎng)。經該體系培養(yǎng)的MSCs可用于臨床治療等用途。

4.1、人骨髓間充質干細胞培養(yǎng)
1.將骨髓樣品制備成單細胞懸液，推薦使用密度梯度離心法獲得單個核細胞進行以下實驗。

★ 注意：人骨髓單個核細胞的分離，可采用Ficoll-Hypaque（比重1.077g/mL），或Percoll（比重1.073g/mL）。后者毒性小，且分離細胞純度較好。

2.PBS清洗細胞兩次。

★ 注意：兩次離心速度不同。第一次收集的細胞懸液中含有Ficoll-Hypaque或Percoll，應加足量PBS稀釋，離心速度不低于密度梯度離心時的速度。第二次離心時，可用常規(guī)速度沉降細胞。

3.棄上清，用完全培養(yǎng)基重懸細胞。

4.細胞計數，調整細胞濃度為5～7.5×106/mL。

5.根據擬采用培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿的底面積，計算接種細胞總量。一般而言，細胞來源不同，接種密度可適當調整， 5～10×105/cm2適于多數情況下人骨髓間充質干細胞的培養(yǎng)。如細胞來源于G-CSF動員的骨髓或經膠原酶消化的骨髓小粒，接種密度可較低；如細胞來源于化療后骨髓或老年人，細胞接種密度可達1.0×106/cm2。

6.將接種好的細胞置于5% CO2，濕度大于95%的37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。根據細胞生長狀況換液。

★ 注意：一般文獻推薦培養(yǎng)48小時后去除非貼壁細胞。然而，骨髓單個核細胞培養(yǎng)48小時后，將貼壁細胞與非貼壁細胞分別培養(yǎng)，兩種體系收獲的骨髓MSCs數量相近。因此，我們強烈推薦：單個核細胞接種次日觀察有無污染；如無污染現象，可持續(xù)培養(yǎng)5～7天，或至培養(yǎng)基變黃。之后，去除非貼壁細胞，加入新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

4.2、人臍帶間充質干細胞培養(yǎng)
1.按照常規(guī)方法分離人臍帶Walton膠中的細胞。

★ 注意：從臍帶組織中分離細胞的方法，嚴重影響最終所得細胞純度和質量。臍帶組織中含有內皮細胞、上皮細胞、平滑肌細胞、外膜細胞、間充質干細胞乃至單核巨噬細胞等。以上細胞均可貼壁，有些生長速度也較快，且細胞也多呈紡錘形。這些細胞不易與間充質干細胞區(qū)分。建議：從臍帶剝離Walton膠并剪切成小塊的過程中用生理鹽水反復漂洗干凈 或 使用酶消化法進行間充質干細胞的分離，以保障所得細胞純度。

2.PBS清洗細胞1次。

3.棄上清，用完全培養(yǎng)基重懸細胞。

4.細胞計數，調整細胞濃度為5×106/mL。

5.根據擬采用培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿的底面積，計算接種細胞總量。一般而言，細胞來源不同，接種密度可適當調整，5～7.5×105/cm2適于多數情況下人臍帶間充質干細胞的培養(yǎng)。

6.將接種好的細胞置于5% CO2和100%相對濕度的37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。根據細胞生長狀況換液。

★ 注意：一般文獻推薦培養(yǎng)48小時后去除非貼壁細胞。我們建議：培養(yǎng)次日觀察有無污染；如無污染現象，可持續(xù)培養(yǎng)5～7天，或至培養(yǎng)基顏色變黃。之后，去除非貼壁細胞，加入新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

4.3、脂肪間充質干細胞的分離
1. 人脂肪組織來自脂肪抽吸患者的廢棄脂肪組織。

2. 無菌PBS反復漂洗除菌。

3. 將脂肪組織轉移至50mL或250mL離心管，加入等體積的使用alpha-MEM配制的膠原酶溶液，使其終濃度達到0.1%（重量/體積）。

4. 37℃，搖床（120rpm）消化2小時以上。

5. 室溫靜置10分鐘，吸除上層油滴。

6. 離心，800g，10分鐘，收集消化細胞。

7. PBS洗滌一次，500g，10分鐘。MSCs無血清完全培養(yǎng)基懸浮細胞。

8. 計細胞數，調整細胞濃度，按照5～10×105/cm2底面積接種。

9. 次日觀察，如無污染，繼續(xù)培養(yǎng)至培養(yǎng)基顏色變黃，或貼壁細胞密度達到30%以上。補充新鮮的MSC無血清完全培養(yǎng)基。

10. 細胞密度達到80%左右時，按照以下步驟傳代培養(yǎng)。

4.4、間充質干細胞的換液
吸去舊的間充質干細胞的完全培養(yǎng)液，加入足量新鮮的預熱至37℃的間充質干細胞完全培養(yǎng)液。

換液時間：當間充質干細胞的完全培養(yǎng)液變酸（培養(yǎng)液的顏色變黃），而且此時細胞尚未達到80%融合，則應該予以換液。一般來說，間質干細胞的換液間隔為3～4天。

4.5、間充質干細胞的傳代
間充質干細胞生長至80％融合時，就應該按照下面步驟進行傳代。

★注意：為保證間充質干細胞的多向分化能力和增殖能力，強烈建議細胞達80%時即進行傳代培養(yǎng)。如細胞密度過大，細胞會出現自發(fā)分化現象，表現為細胞大小不一，I型膠原等胞外基質分泌量明顯增加，導致使用胰蛋白酶消化時，細胞成片脫落，最終收獲的細胞數反而下降。因此，不可讓間充質干細胞完全融合或過度融合，這將嚴重影響細胞的生長狀態(tài)。建議：48～66小時之間，就要加強觀察，避免細胞生長過密。

1. 吸去培養(yǎng)液。

2. 用1×PBS洗滌細胞2次，以去除殘留的培養(yǎng)液。

★注意：使用該無血清體系培養(yǎng)的間充質干細胞，其貼壁能力微弱于血清培養(yǎng)細胞。因此，如用培養(yǎng)皿培養(yǎng)，建議沿培養(yǎng)皿的側壁緩緩加入PBS；如用培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，建議沿培養(yǎng)瓶的上壁加入PBS，以免細胞脫落，影響收獲細胞數。

3. 加入PBS，之后加入0.25％Trypsin-0.1%EDTA，PBS與胰蛋白酶體積比為4:1，兩者總量以覆蓋培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶表面為宜。輕輕旋轉，置37℃培養(yǎng)箱中消化3～5分鐘。用手輕拍培養(yǎng)器皿的壁，顯微鏡下可見絕大部分細胞變圓，極少量細胞貼壁仍呈紡錘形，極少量細胞已經懸浮即可終止消化。依據不同批次胰蛋白酶活性不同，消化的時間以顯微鏡下觀察細胞變圓為準，但是，推薦消化時間不低于3分鐘。

★注意：對于人間充質干細胞，尤其是利用該體系培養(yǎng)的細胞而言，其消化脫壁的時間應該較短，難以消化脫壁的細胞多數可能不是間充質干細胞，而是其他的雜細胞。在原代培養(yǎng)第一次傳代時，尤其注意消化時間；如將所有細胞收獲，其中必然含有單核巨噬細胞等雜細胞。

4. 立即加入等體積的間充質干細胞完全培養(yǎng)液，用吸管吸取液體，反復吹打培養(yǎng)器皿底壁，使細胞徹底脫離瓶皿底壁。

★注意：吹打時動作不宜過猛，避免產生氣泡。對于一個細胞而言，氣泡的張力很大，其破裂足以殺死周圍的細胞，導致細胞內基因組DNA釋放，細胞呈粘稠的團狀物，會嚴重影響細胞收獲的數量和質量。

5. 離心（250g，5分鐘），吸去上清液。

6. 用2～3mL間充質干細胞的完全培養(yǎng)液重懸細胞。

7. 按照6000個細胞/cm2的密度來接種細胞。

8. 加足夠的間充質干細胞的完全培養(yǎng)液，在37℃，5％ CO2和100%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

使用CCGmHuM? E8 Cocktail human MSCs Serum-Free Medium人間充質干細胞無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)臍帶間充質干細胞細胞形態(tài)圖

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