QIAGEN REPLI-g單細(xì)胞基因組分析試劑的相關(guān)原理

放大原理

REPLI-g Single Cell Kit 使用等溫基因組擴(kuò)增，稱為多重置換擴(kuò)增 (MDA)，它涉及隨機(jī)六聚體與變性 DNA 的結(jié)合，然后在恒溫下使用優(yōu)化形式的 Phi 29 聚合酶進(jìn)行鏈置換合成，具有異常強(qiáng)的鏈置換特性。額外的引發(fā)事件發(fā)生在作為模板的每條被取代的鏈上，從而能夠產(chǎn)生高產(chǎn)量的擴(kuò)增 DNA（見圖“ 多位移放大（MDA）技術(shù)”）。Phi 29 聚合酶是一種噬菌體衍生酶，是一種具有 3’→5′ 引物核酸外切酶活性（校對(duì)活性）的DNA 聚合酶，其保真度比Taq DNA 聚合酶高 1000 倍。在獨(dú)特、優(yōu)化的 REPLI-g 單細(xì)胞緩沖液系統(tǒng)的支持下，Phi 29 聚合酶可輕松解析二級(jí)結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾環(huán)，從而防止聚合酶在擴(kuò)增過程中滑動(dòng)、停止和解離。這使得生成高達(dá) 100 kb 的 DNA 片段而沒有序列偏差。

細(xì)胞裂解和 DNA 堿變性

基因組 DNA 在用于酶促擴(kuò)增程序之前必須變性，這通常使用苛刻的方法來完成，例如在高溫下孵育（熱孵育）或增加 pH 值（化學(xué)堿性孵育）。REPLI-g Single Cell Kit 使用溫和的堿性孵育，允許細(xì)胞裂解和 gDNA 的均勻 DNA 變性，DNA 片段化或無堿基位點(diǎn)的產(chǎn)生非常低。這導(dǎo)致擴(kuò)增的 DNA 具有非常高的完整性，并使擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度，從而使基因組位點(diǎn)和序列均勻呈現(xiàn)。

有效消除可檢測(cè)的 DNA 污染

所有 REPLI-g Single Cell Kit 組件都經(jīng)過獨(dú)特的受控凈化程序，以確保消除所有 REPLI-g 可擴(kuò)增的 DNA 污染。緩沖液和試劑通過創(chuàng)新和標(biāo)準(zhǔn)化的程序暴露在紫外線輻射下，以確保不存在任何可檢測(cè)的殘留污染 DNA（見圖“ 創(chuàng)新的去污程序”）。紫外線處理后，試劑盒經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量控制，以確保功能齊全。