杜克大學(xué)的生物醫(yī)學(xué)工程師已經(jīng)開發(fā)出一種方法，可以將CRISPR基因組編輯技術(shù)的準(zhǔn)確性平均提高50倍。他們相信它可以很容易地轉(zhuǎn)換為任何編輯技術(shù)不斷擴展的格式。

該方法為引導(dǎo)RNA添加了短尾，其用于鑒定用于編輯的DNA序列。這種添加的尾部向后折疊并與其自身結(jié)合，形成“鎖定”，只能被靶DNA序列解除。

該研究于4月15日在線發(fā)表在Nature Biotechnology雜志上。

“CRISPR通常具有令人難以置信的準(zhǔn)確性，但有一些例子表明了脫靶活動，因此在整個領(lǐng)域?qū)μ岣咛禺愋杂袕V泛的興趣，”杜克大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程魯尼家族副教授Charles Gersbach說?！暗侥壳盀橹固岢龅慕鉀Q方案不能在不同的CRISPR系統(tǒng)之間輕松轉(zhuǎn)換?！?/p>

CRISPR / Cas9是一種防御系統(tǒng)，細(xì)菌用于靶向和切割入侵病毒的DNA。雖然第一個被設(shè)計用于人體細(xì)胞的CRISPR技術(shù)源自一種名為化膿性鏈球菌的細(xì)菌，但更多的細(xì)菌物種帶有其他形式。

該領(lǐng)域的科學(xué)家花了數(shù)年時間尋找具有所需特性的新CRISPR系統(tǒng)，并不斷添加到CRISPR庫中。例如，一些系統(tǒng)較小并且能夠更好地適合病毒載體內(nèi)部以遞送至人細(xì)胞用于基因治療。但無論他們的個人能力如何，所有人都有時會產(chǎn)生不必要的遺傳編輯。

CRISPR系統(tǒng)的一個共同特性是它們使用RNA分子作為指導(dǎo)，其位于基因組中的靶DNA序列上。一旦指導(dǎo)RNA找到其互補的基因序列，Cas9酶就像剪刀一樣在DNA中切割，促進(jìn)基因組序列的改變。但是因為每個歸巢序列只有20個核苷酸長，而人類基因組含有大約30億個堿基對，所以需要排序很多，并且CRISPR有時會出現(xiàn)錯誤，序列中有一個或兩個堿基對缺乏完美。

提高CRISPR準(zhǔn)確性的一種方法是需要兩個Cas9分子結(jié)合到相同DNA序列的相對側(cè)上，以進(jìn)行完全切割。雖然這種方法有效，但它會給系統(tǒng)增加更多部件，增加其復(fù)雜性并使其更難以交付。

另一種方法是對Cas9蛋白進(jìn)行基因工程改造，使其不那么精力充沛，因此不太可能跳槍并犯錯誤。雖然這也顯示出有希望的結(jié)果，但這種類型的蛋白質(zhì)工程是費力的，并且這種努力對于每個CRISPR系統(tǒng)是特異性的。

“看起來幾乎每周都會發(fā)現(xiàn)一種新的CRISPR系統(tǒng)，它具有某種獨特的性質(zhì)，使其對特定的應(yīng)用非常有用，”Gersbach說?！懊慨?dāng)我們發(fā)現(xiàn)新的CRISPR蛋白質(zhì)以使其更準(zhǔn)確時，進(jìn)行廣泛的重新設(shè)計并不是一個簡單的解決方案?！?/p>

“我們專注于不添加更多部件的解決方案，并且對于任何類型的CRISPR系統(tǒng)都是通用的，”負(fù)責(zé)該項目的Gersbach實驗室的博士生Dewran Kocak說?！八蠧RISPR系統(tǒng)的共同點是指導(dǎo)RNA，這些短RNA更易于設(shè)計。”

Gersbach和Kocak的解決方案是將引導(dǎo)RNA延伸多達(dá)20個核苷酸，使其折疊回自身并結(jié)合到原始指導(dǎo)RNA的末端，形成發(fā)夾形狀。如果在針對潛在切割進(jìn)行仔細(xì)檢查的DNA序列中即使單個堿基對不正確，也會產(chǎn)生一種非常難以置換的鎖定。但是因為指導(dǎo)RNA更喜歡與DNA而不是自身結(jié)合，DNA的正確組合仍然能夠打破鎖定。

“我們能夠?qū)︽i的強度進(jìn)行微調(diào)，以便指導(dǎo)RNA在達(dá)到正確匹配時仍能正常工作，”Kocak說。

在該論文中，Kocak和Gersbach表明，這種方法可以將來自四種不同細(xì)菌菌株的五種不同CRISPR系統(tǒng)的人體細(xì)胞切割的準(zhǔn)確性提高平均50倍。在一個案例中，改善上升到200多倍。

“這是一個非常簡單的想法，盡管Dewran完成了數(shù)年的研究，表明它的工作方式與我們認(rèn)為它的工作方式相同，”Gersbach說?！斑@是一個很好的，優(yōu)雅的解決方案，可以擺脫脫靶活動。”

展望未來，研究人員希望能夠看到這種方法可以使用多少種不同的CRISPR變體，并完整地深入表征鎖定機制如何工作以查看CRISPR變體之間是否存在差異。由于這些實驗是在培養(yǎng)的細(xì)胞中進(jìn)行的，研究人員迫切希望看到這種方法在實際動物疾病模型中如何提高CRISPR的準(zhǔn)確性。