BeYaMA^TM 1干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)操作手冊：

一、   培養(yǎng)皿包被

1、      4℃溶解Matrigel（BD 354277）過夜，輕搖混勻。請注意：原液應(yīng)是均質(zhì)粘稠的半流體狀態(tài)，要避免溫度過高，否則Matrigel會變成凝膠狀態(tài)。

2、      冰上預(yù)冷1.5ml離心管和移液器槍頭，冰上快速將Matrigel分裝成350-500ul/支，儲存于-80℃，用前置于4℃解凍。

3、      將溶解的Matrigel加入25ml預(yù)冷的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基中，輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡。

4、      將稀釋的Matrigel加入六孔板中，1ml/孔，輕搖培養(yǎng)板，使Matrigel均勻鋪在培養(yǎng)板底部。

5、      Parafilm封好包被的培養(yǎng)板，置于4℃儲存，用前置于37℃培養(yǎng)箱中孵育至少1小時。

二、   培養(yǎng)液準(zhǔn)備

1、      在4℃解凍BeYaMA^TM 15X Supplement（貨號：HJ0103M）添加劑，加入BeYaMA^TM 1Basal Medium（貨號：HJ0102M）基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，形成500mL BeYaMA^TM 1 Complete Medium（貨號：HJ0101M）完全培養(yǎng)基。

2、      BeYaMA^TM 1完全培養(yǎng)基可在4℃穩(wěn)定儲存2周?？砂磳?shí)際用量將BeYaMA^TM 1完全培養(yǎng)基分裝后置于-80或-20℃保存，避免反復(fù)凍融。

三、   hESCs/hiPSCs復(fù)蘇

1、      復(fù)蘇hESCs/hiPSCs前，復(fù)溫Matrigel包被的培養(yǎng)板，吸棄孔內(nèi)液體，加入2ml BeYaMA^TM 1完全培養(yǎng)液及2ul 5uM/L Rock Inhibitor Y27632，用以促進(jìn)細(xì)胞貼壁。

2、      從液氮罐中取出hESCs/hiPSCs凍存管，浸入37℃水浴，輕輕搖晃，直到細(xì)胞融化至僅剩一小塊冰晶，迅速取出并用75%酒精擦拭凍存管外表面，轉(zhuǎn)移至無菌超凈臺中。

3、      將細(xì)胞懸液接種至準(zhǔn)備好的培養(yǎng)板中，輕輕晃動使細(xì)胞均勻分布在板底。

4、      小心將培養(yǎng)板放置于培養(yǎng)箱中，避免振動。

5、      30-90min后顯微鏡下觀察細(xì)胞基本貼壁，更換新鮮BeYaMA^TM 1完全培養(yǎng)液，之后每24h換液，4-6天后傳代。

四、   hESCs/hiPSCs傳代

1、    提前準(zhǔn)備好Matrigel（BD 354277）包被過的六孔板，吸棄孔內(nèi)包被液，加入2ml BeYaMA^TM 1完全培養(yǎng)液。

2、    吸棄待傳代hESCs/hiPSCs孔內(nèi)的培養(yǎng)液，并用1ml無鈣鎂的PBS洗1遍。

3、    加入0.5ml Accutase細(xì)胞分離液使之完全覆蓋皿底。

4、    室溫孵育5-8分鐘或37℃孵育3-5分鐘，顯微鏡下觀察到大部分克隆細(xì)胞間出現(xiàn)間隙，細(xì)胞表面發(fā)亮但尚未相互分離時，可吸去Accutase。

5、    可將培養(yǎng)板放置37℃繼續(xù)孵育1min,或者直接加入適量新鮮BeYaMA^TM 1完全培養(yǎng)液，輕輕搖晃，干細(xì)胞集落基本脫落。亦可用細(xì)胞刮刀將剩余克隆輕輕刮下，盡量避免用槍頭反復(fù)吹打細(xì)胞。

6、    將制備好的細(xì)胞懸液按1：3 – 1：6的比例接種至準(zhǔn)備好的培養(yǎng)板中，注意細(xì)胞過密則克隆邊界不圓滑，易分化，細(xì)胞過稀則克隆存活率降低。

7、    輕輕搖晃培養(yǎng)板讓細(xì)胞均勻分散，置于37℃，5% CO²培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

8、    每天更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞密度達(dá)到80%以上，或者克隆中央密度過大，影響細(xì)胞生長時進(jìn)行傳代。

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